Men xúc tác thuỷ phân protein (Proteases) là một sản phẩm tiên tiến được sử dụng để cải thiện hệ số chuyển đổi thức ăn. Nhờ vào khả năng thủy phân của nó, nó giúp tăng cường khả năng hấp thu axit amin, điều này giúp làm giảm hàm lượng đạm yêu cầu trong khẩu phần và làm giảm chi phí thức ăn.

Enzyme proteinase tương tự subtilisin (subtilisin-like proteinase -AprBp) của loài vi khuẩn Bacillus pumilus 3-19 là một ứng viên sáng giá cho ngành công nghiệp sản xuất gia cầm, được sử dụng như một chất phụ gia thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, để đạt được lượng enzyme cao, việc xây dựng một hệ thổng biểu hiện (gen) hiệu quả cao là điều cần thiết.

Mục tiêu của nghiên cứu là đạt được khả năng biểu hiện ổn định của gen mã hóa protease ở chủng B. pumilus 3-19 trong hệ thống biểu hiện gen của  Pichia pastoris và đánh giá mối liên quan của hoạt dộng enzyme với các chọn lựa loại vector và đoạn peptide tín hiệu. Trong nghiên cứu này, để đạt được khả năng biểu hiện gen ổn định và tối đa của gen quy định proteases trong tế bào nấm men hướng methyl[MOU1] , các vector pPINK-HC và pPINK-LC đã được lựa chọn. Để tế bào tiết ra enzyme tái tố hợp protease, các đoạn peptide tín hiệu hiệu quả cao đã được sử dụng. Qúa trình phiên mã  của nhân tố α (α -mating factor) lặp lại nhiều lần dẫn đến sự gia tăng tiết ra các protein tái tổ hợp của tế bào. Mặt khác, trình tự của peptit tín hiệu giết và lysozyme trước đây chưa được sử dụng để kiểm tra biểu hiện gen- protease của vi khuẩn ở P. pastoris.

Các khuẩn lạc biến nạp có cấu trúc dựa trên vectơ pPINK-LC được phát hiện vào ngày thứ 3 của quá trình nuôi cấy và cho thấy hiệu quả biến nạp cao hơn so với các khuẩn lạc có cấu trúc dựa trên vectơ pPINK-HC (chỉ được phát hiện vào ngày thứ 7 của quá trình nuôi cấy). Hiệu suất biến nạp vào ngày thứ 10 của quá trình nuôi cấy đối với các khuẩn lạc dựa trên vectơ pPINK-LC đạt trung bình 1,3 × 10³ biến nạp/ μg DNA, so với mức 1,03 × 10³ biến nạp / μg DNA được ghi nhận cho các khuẩn lạc với vectơ pPINK-HC. Kết quả kiểm tra PCR khuẩn lạc cho thấy rằng tất cả các khuẩn lạc biến nạp được chọn đều chứa gen quy định protease giống subtilisin đã được tích hợp vào bộ gen của nấm men.

Nghiên cứu chỉ ra rằng thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease ở P. pastoris, và hoạt động tối đa của enzyme đã được quan sát thấy. Các chủng nấm men có cấu trúc dựa trên vectơ sao chép mức thấp pPINK-LC cho thấy hoạt tính sản xuất protease cao hơn (U / ml) trong quá trình thủy phân azocasein (2,63 ± 0,16 đối với peptit tín hiệu giết (SP), 2,49 ± 0,08 đối với tỷ lệ trước nhân tố α, 2,19 ± 0,11 đối với lysozyme SP) so với các chủng có cấu tạo dựa trên vectơ pPINK-HC (1,86 ± 0,09 đối với SP giết, 2,21 ± 0,07 đối với tỷ lệ nhân tố α, 1,31 ± 0,11 đối với lysozyme SP), bất kể peptit tín hiệu nào là đã sử dụng. Hoạt động protease tối đa thu được đối với các chủng nấm men có cấu trúc pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U / ml) và pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U / ml).

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng enzyme protease giống -subtilisin thu từ các chủng P. pastoris tái tổ hợp thể hiện hoạt tính phân giải protein, điều này phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy và sự lựa chọn của peptide và vector tín hiệu. Việc sản xuất protease của vi khuẩn bằng việc tích hợp gen vi khuẩn vào nấm men thành công khiến cho đây là hệ thống sản xuất đầy hứa hẹn hỗ trợ cho việc phát triển của các chất phụ gia thức ăn mới trong chăn nuôi.

Protease được đánh giá là một trong ba nhóm enzyme sử dụng trong ngành công nghiệp lớn nhất và chiếm khoảng 60% tổng lượng enzyme bán ra toàn cầu, 40% trong số đó thuộc về protease vi khuẩn. Protease serine của vi khuẩn có đặc tính cơ chất lớn và khả năng chống chịu cao với các điều kiện khác nhau, điều này đảm bảo việc sử dụng chúng trong công nghệ sinh học, đặc biệt là chất phụ gia sinh học cho gia cầm và loài cật nuôi khác trong trang trại. Ngoài ra, việc bổ sung protease vào thức ăn giúp tăng cường sự hấp thụ các axit amin của vật nuôi và tiết kiệm kinh phí mua các axit amin tổng hợp. Nó cũng đã được chứng minh rằng việc sử dụng protease làm chất phụ gia thức ăn chăn nuôi làm tăng khả dụng sinh học của nitơ, do đó làm giảm mức độ ô nhiễm amoniac trong đất. Ngoài ra, protease tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của các enzym khác và tăng hiệu quả chi phí của thức ăn, cũng như thúc đẩy sự phát triển của hệ vi sinh có lợi trong đường ruột của gà thịt.

Ngày nay, một số lượng hạn chế các protease thương mại từ các nhà sản xuất nước ngoài được sử dụng ở Nga. Các đại diện chính trên thị trường Nga là phụ gia thức ăn chăn nuôi nhập khẩu CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), Mỹ), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Thụy Sĩ), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Đức) . Công nghệ tái tổ hợp thu giúp thu được các chủng P. pastoris có gen mã hóa protease của vi khuẩn giống subtilisin (aprBp) và ba peptit tín hiệu khác nhau (nhân tố α, protein giết và lysozyme). Việc thúc đẩy mức độ biểu hiện và quy trình tinh lọc protease từ chất lỏng nuôi cấy nấm men và nghiên cứu các đặc tính sinh hóa và enzym sẽ giúp đánh giá triển vọng của công nghệ sinh học để sản xuất  enzyme tái tổ hợp.